Terapia Epigenómicaen la Neumonía

Tema:La eliminación genética de Sphk2 confiere protección contra Pseudomonas aeruginosa mediada por la expresión diferencial de genes relacionados con infección virulenta e inflamación en pulmón de ratón.

Mecanismo epigenómico tratado: Tridimensionalidad del ADN, en el gen Sphk2/S1P

Cómo se lo hizo: 
1. Eliminación del gen Sphk2 ,
2. Exposición del ratón a AP , y
3. Interacción de la desactivación del gen Sphk2 y AP,

Resultados: Se identificaron genes expresados ​​diferencialmente después de la infección por PA usando el transcriptoma completo de ratones Sphk2 - / - y sus contrapartes WT. Los análisis de enriquecimiento de la ruta (PW) de los datos de la secuencia de ARN identificaron varias rutas de señalización que probablemente desempeñen un papel crucial en la neumonía causada por la AP,
1. Respuesta inmune a la infección por PA y la transducción de la señal NF-κB; como son:
2. Transducción de señal PKC;
3. Impacto en la regulación epigenética ;
4. Vía del canal epitelial de sodio;
5. Expresión de mucina; y
6. Vías relacionadas con infecciones bacterianas.
Nuestros datos genómicos sugieren un papel potencial para SPHK2 en la neumonía inducida por PAa través de la expresión elevada de genes inflamatorios en el tejido pulmonar. Además, la validación por RT-PCR en 10 genes expresados ​​diferencialmente mostró un 100% de concordancia en términos de cambios vectorales, así como un cambio significativo de veces.
La señalización S1P / SPHK2 podría desempeñar un papel clave en la promoción de la neumonía por AP . Los genes identificados promueven la inflamación y suprimen otros que inhiben naturalmente la inflamación y la defensa del huésped. Por lo tanto, apuntar a la señalización de SPHK2 / S1P en la inflamación pulmonar inducida por PA podría servir como una terapia potencial para combatir la neumonía inducida por PA

Referencia:

1. Ebenezer, D., Fu, P., Krishnan, Y., Maienschein-Cline, M., Hu, H., & Jung, S. et al. (2020). Genetic deletion of Sphk2 confers protection against Pseudomonas aeruginosa mediated differential expression of genes related to virulent infection and inflammation in mouse lung. Retrieved 12 January 2020, from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6916461/

Técnicas de Edición de Acidos Nucléicos en la Neumonía Neumocócica

Tema: Terapia génica para la neumonía de tipo infecciosa

Tipo de edición: células somáticas in vivo

Dirigido hacia: ADN, alelo C/T del gen que codifica la proteína FER (Feline-sarcoma related to fes/fps)

Dirigido por: Electroporación Pulmonar por un plasmido, OAS

Órgano a tratar: Pulmón (Parénquima pulmonar y epitelios)

Vía de Administración: Parenteral (Intravenosa).

Resultados:  En efecto la transmisión genética de las subunidades de la bomba sodio-topacio ATPasa mejoraron el movimiento de agua y sal hacia afuera del pulmón disminuyendo a su vez la severidad de la respuesta inflamatoria, el alelo C/T de la proteína FER era protectora con una reducción de la mortalidad de 44 % en pacientes con neumonía y septicemia.

Esta terapia génica podría tratar ciertos trastornos mediante la reparación de  defectos genéticos implicados en la regeneración pulmonar. El uso de esta técnica podría permitir abrir nuevos caminos a tratamientos innovadores y menos tortuosos mediante la inserción o reemplazo de un gen en las células de un paciente en lugar de usar las terapias convencionales que tal ves mas adelante se verían rudimentarias ante los ojos de la nueva tecnología y conocimiento en medicina. Para aplicar esta terapia se necesita conocer: Qué gen o genes están afectados y los Factores genéticos en la enfermedad

Bibliografías.

1. Machado-Aranda D. El uso de terapia genética pulmonar en el tratamiento de modelos experimentales de neumonía y septicemia [Internet]. PubMed Central (PMC). 2020 [cited 7 January 2020]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6086359/

Terapia con Stemcells en Neumonía

Tema: El trasplante de células madre mesenquimatosas alogénicas compactas derivadas de hueso atenúa la gravedad del síndrome de neumonía idiopática en un modelo de trasplante de médula ósea murina. 

Tipo de Stem Cells: Células madre mesenquimatosas derivadas de hueso compacto. 

Método de obtención: Obtenidas de ratones C57BL/6 (fecundación in vitro) utilizando tratamiento de colagenasa. 

Vía de Administración: Parenteral.

Resultados: El cotransplante de CB-MSC atenuó significativamente la gravedad de las lesiones pulmonares y aumentó la tasa de supervivencia de los ratones en comparación con los ratones no cotransplantados. Un mayor porcentaje de Treg, la reducción de los niveles de TNF-α, IFN-γ, CCL5, CXCL9 y CXCL10, la regulación negativa de CXCR3 y CCR5, así como la regulación positiva de CCR7, se observaron en los ratones de cotrasplante de MSCs. Además, el efecto profiláctico de las CB-MSC se asoció con un cambio del equilibrio Th1 / Th2 hacia la polarización Th2 antiinflamatoria.

Conclusiones: Las CB-MSC alogénicas controlaron efectivamente la aparición de IPS debido a su profunda capacidad inmunomoduladora. Esto puede ofrecer un nuevo enfoque profiláctico para IPS después de allo-HSCT.

Referencías Bibliográficas.

1. Lung Institute | Stem Cell Treatment Basics [Internet]. Lung Institute. 2017 [cited 17 December 2017]. Available from: https://lunginstitute.com/treatment/stem-cell-treatment-basics/
2. Qiao SK e. Allogeneic Compact Bone-Derived Mesenchymal Stem Cell Transplantation Attenuates the Severity of Idiopathic Pneumonia Syndrome in a Murine Bone Mar... - PubMed - NCBI [Internet]. Ncbi.nlm.nih.gov. 2016 [cited 17 December 2017]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28006781

La apoptosis alveolar de macrófagos ayuda a prevenir la neumonía

Objetivos: definir el papel y el mecanismo de la muerte bacteriana asociada a la apoptosis por AM en el pulmón.

Animal Transgenico: ratón transgénico CD68.hMcl-1 único con sobreexpresión específica de macrófagos de la proteína Mcl-1 antiapoptótica humana.

Métodos: un factor regulado por incremento en las AM de pacientes con mayor riesgo de neumonía adquirida en la comunidad, para abordar el requisito de apoptosis. asesinato asociado.

Mediciones y resultados principales: los macrófagos transgénicos y de tipo salvaje demostraron una ingestión comparable y la muerte inicial de bacterias por fagolisosomas. La ingestión continua (durante ≥12 h) superó la muerte inicial, y una segunda respuesta microbicida de fase tardía mató a las bacterias viables en los macrófagos de tipo salvaje, pero esta respuesta se redujo en los macrófagos transgénicos CD68.hMcl-1.

Conclusiones: la regulación ascendente de Mcl-1 previene la muerte asociada a la apoptosis de macrófagos y establece que la muerte asociada a la apoptosis es necesaria para permitir que las AM eliminen las bacterias ingeridas. La participación de la apoptosis de macrófagos debe investigarse como una nueva estrategia antimicrobiana basada en el huésped.

Transgénicos

Beneficios: Las aplicaciones potenciales y reales que aportan los animales transgénicos son múltiples. En primer lugar, mejoran la investigación básica, ya que facilitan un mayor entendimiento de los mecanismos de funcionamiento y control de los genes. En segundo lugar, benefician la producción animal, permitiendo la obtención de un mayor crecimiento con un menor consumo de energía. Asimismo, permiten modificar específicamente ciertas características de productos alimenticios, como la leche, haciéndolos más adecuados para el consumo humano o más fácilmente transformables por la industria. Su aplicación alcanza también el ámbito de la Sanidad, ya que la transgénesis facilita el desarrollo de modelos animales para el estudio de enfermedades humanas o animales, y ayuda en el entendimiento de mecanismos tan importantes como la proliferación y la diferenciación celular.

Riesgos: La transgénesis, como sistema de mejora genética, puede tener las mismas consecuencias negativas que han causado la pérdida de cientos de razas autóctonas en todo el mundo, al introducir otras con mejores características productivas, los animales alterados genéticamente que se cruzan con otras especies pueden crear híbridos y mutaciones que pueden infectar el patrimonio genético completo de una especie, llevándolo a la aniquilación y posiblemente la extinción. Solo sería necesaria una hembra preñada para comenzar una reacción de reproducción fuera de control y el impacto podría ser muy rápido. La posibilidad de liberar animales transgénicos a la vida silvestre puede tener un gran impacto negativo sobre las especies naturales, además del ecosistema. Los animales que portan defectos transgénicos, agentes patógenos, virus y bacterias constituyen una amenaza grave para otros animales e incluso para las plantas. En la alimentación los animales transgénicos pueden causar alergias al consumidor.

Bibliografías.-

1. Atsjournals.org. (2019). Alveolar Macrophage Apoptosis–associated Bacterial Killing Helps Prevent Murine Pneumonia | American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. [online] Available at: https://www.atsjournals.org/doi/abs/10.1164/rccm.201804-0646OC?rfr_dat=cr_pub%3Dpubmed&url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori%3Arid%3Acrossref.org&journalCode=ajrccm [Accessed 22 Dec. 2019].

2. Atsjournals.org. (2019). Alveolar Macrophage Apoptosis–associated Bacterial Killing Helps Prevent Murine Pneumonia | American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. [online] Available at: https://www.atsjournals.org/doi/abs/10.1164/rccm.201804-0646OC?rfr_dat=cr_pub%3Dpubmed&url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori%3Arid%3Acrossref.org&journalCode=ajrccm [Accessed 22 Dec. 2019].

3. EcoPortal.net. (2019). Animales transgénicos: un mal no necesario - EcoPortal.net. [online] Available at: https://www.ecoportal.net/temas-especiales/transgenicos/animales-transgenicos-un-mal-no-necesario/ [Accessed 22 Dec. 2019].

ADN Recombinante en la Neumonía Neumocóccica

ADN recombinante en la naturaleza. En la naturaleza se generan transgénicos, aunque en tiempos prolongados. Por ejemplo, determinados agentes infecciosos incorporan material genético al genoma de su huésped, como lo hace la bacteria Agrobacterium Tumefaciens desde hace millones de años con los vegetales que infecta.
Con la  "colonización genética" se obliga a las planta a fabricar una sustancia de la que solo se puede nutrir esta bacteria, (Agrobacterium Tumefaciens). La bacteria es atraída por sustancias que excreta la planta en sus zonas abiertas por pequeñas heridas. Por allí se introduce, y es entonces cuando transfiere a la célula vegetal un trozo de su material genético: una porción de un plásmido (ADN extracelular cromosómico bactriano), que se integrará en alguna zona del genoma de la planta.

ADN recombinante artificial en la Neumonía.

Tema: Ingeniería genética o tecnológica del ADN recombianate.

Objetivo: Crear moléculas recombinantes entre segmentos de ADN que no presentan homología y que pueden proceder de organismos diversos.

Gen: Gen amp, Gen tet.

Enzima de restricción: Pstl, BamHI y Sall.

Enzima ligasa: No se específica.

Vector: Tipo plasmido

Célula receptora: Célula bacteriana.

Método de inserción del gen: Transformación.

Método de identificación: Electroforesis de proteínas, Elisa.

Usos: En los procesos de clonación se utiliza un gran número de células. Al final del proceso se hace necesario separar las células que contienen ADN recombinante de las que no lo contienen. La detección y la selección de colonias se realiza en los medios de cultivo. En los procesos de clonación se obtienen células anfitrionas que no han incluido el vector, células recombinantes, es decir, que han incluido el vector con el ADN para recombinar, y células anfitrionas con vector que no lleva el ADN inserto. Los métodos para detectar y seleccionar son: Método de hibridación: se utiliza una sonda marcada que hibrida con el ADN recombinante o con el ARN mensajero que se transcribe a partir de él. Método inmunológico: se detecta la proteína codificada en el ADN recombinante mediante anticuerpos específicos. Métodos genéticos: que, a su vez, pueden ser: Inserción del vector y el ADN recombinante en un gen de la célula anfitriona que queda desactivado. Por ejemplo, si la colonia no produce enzima lactasa, es que el ADN recombinante se encuentra dentro del ADN bacteriano en ese gen. Vector con genes de resistencia a un antibiótico: en el medio se agrega el antibiótico y sólo crecerá aquella colonia que sea resistente a él, por tanto, que porte el ADN. Colonias con defectos nutricionales: se utilizan células anfitrionas mutantes que no puedan sintetizar, por ejemplo, un aminoácido. Para que la colonia sobreviva, el aminoácido debe ser añadido al medio de cultivo. Empleando un vector que lleve el gen correcto para la síntesis de dicho aminoácido, haciendo crecer las colonias celulares en medios carentes de él sólo crecerán las bacterias que lleven el ADN inserto.





Referencias bibliográficas:

1. Román D. Ingeniería genética o tecnología del ADN recombinante [Internet]. Ivu.org. 2017 [cited December 2019]. Available from: https://ivu.org/spanish/trans/ssnv-genetic.html
2. Biologia i [Internet]. Google Books. 2017 [cited December 2019]. Available from: https://books.google.com.ec/books?id=1R9FQ1xF3iEC&pg=PA84&lpg=PA84&dq=adn+se+recombina+de+forma+natural&source=bl&ots=KH4pzPh7Vt&sig=Bhu1PabBgwTqclmaZWCcbr8uDJY&hl=es&sa=X&ei=djG3UMawJbOq0AHSlIGADw#v=onepage&q&f=true

Técnica Molecular Epigenómica en la Neumonía Neimocóccica (PCR de miRNAs)

Tema: miRNA-302e atenúa la inflamación en la neumonía a través de la vía de señalización RelA / BRD4 / NF-κB

Objetivo: investigar el papel del microARN (miARN) -302e en la neumonía infantil (IP) y explorar los posibles mecanismos de protección.

Muestra: Tejido pulmonar.

Tipo de Ácido nucleico: miRNA-302e.

Gen o secuencia a amplificar: chip de genes para la expresión de miR y ( G) reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa para la expresión de miRNA-302e

Tipo de PCR:  RT-qPCR

Pasos en las condiciones de almacenaje:
Las muestras de tejido pulmonar fijadas con paraformaldehído se incluyeron en parafina y se almacenaron a 4 ° C. Las muestras de tejido pulmonar se cortaron en secciones de 10 μm utilizando una máquina de corte de parafina (RM2235; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemania), se tiñeron con hematoxilina y eosina durante 10 minutos a temperatura ambiente y se observaron bajo microscopía óptica (aumento, x 100; BH3-MJL; Olympus Corporation, Tokio, Japón).

Para investigar los roles de los miRNAs en un modelo de ratón de IP, se analizaron los cambios de los miRNAs. Los niveles de TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-18 aumentaron significativamente en el modelo de ratón de IP en comparación con los ratones simulados (P <0.01; Fig. 1A-D ). La tinción con H&E demostró que los alvéolos pulmonares se redujeron en el modelo de ratón de IP, en comparación con los ratones simulados. Estos resultados de tinción de H&E, TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-18 indicaron que el modelo in vivo se estableció con éxito. Además, la expresión de miRNA-302e disminuyó significativamente en un modelo de ratón de IP en comparación con el grupo simulado (P <0,01; Fig. 1F-G ). Por lo tanto, miRNA-302e puede estar involucrado en la inflamación en la IP.
En conclusión, el presente estudio demuestra que se redujo la expresión de miRNA-302e en modelos IP de ratones. miRNA-302e atenúa la inflamación en IP a través de la vía de señalización RelA / BRD4 / NF-κB. Estos resultados revelan un nuevo papel antiinflamatorio del miRNA-302e en los mastocitos activados, lo que sugiere que miR-302e puede ser un objetivo terapéutico prometedor para el tratamiento de la PI.

Referencías Bibliográficas.-

1. Li S, Cui W, Song Q, Zhou Y, Li J. MiRNA-302e attenuates inflammation in infantile pneumonia though the RelA/BRD4/NF-κB signaling pathway. Int J Mol Med. 2019;44(1):47–56. avalible from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6559299/
2. Launay E, Levieux K, Levy C, Dubos F, Martinot A, Vrignaud B, Lepage F, Cohen R, Grimprel E, Hanf M, et al. El cumplimiento de las recomendaciones actuales para prescribir antibióticos para la neumonía adquirida en la comunidad pediátrica está mejorando: datos de un estudio prospectivo en una red francesa. BMC Pediatr. 2016; 16 : 126. doi: 10.1186 / s12887-016-0661-3.
3.  Aman M. LIBRO DE APOYO DIDACTICO EN BIOLOGIA MOLECULAR FCM UCE marzo 2015 [Internet]. Joomag. 2015 [cited December 2019]. Available from: https://view.joomag.com/libro-de-apoyo-didactico-en-biologia-molecular-fcm-uce-marzo-2015/0169164001409963499?short

Prueba molecular en la Neumonía Neumocóccica (Microarray)

Tema: Exploración de nuevas herramientas seroepidemiológicas: efecto de diferentes condiciones de almacenamiento sobre la estabilidad longitudinal de portaobjetos de microarrays que comprenden antígenos de influenza A, sarampión y Streptococcus pneumoniae.

Objetivo: Desarrollar ensayos para la detección de enfermedades sindrómicas.

Muestra biológica: Antígenos del virus del Streptococcus pneumoniae.

Tipo de ácido nucleico: Polisacáridos capsulares purificados de Streptococcus pneumoniae.

Gen o secuencia a amplificar: Serotipo 14.

Tipo de PCR: Hibridación, microarray.

Pasos en las condiciones de almacenaje:
Todas las diapositivas se almacenaron en condiciones oscuras. La estabilidad de las diapositivas de microarrays manchados se evaluó en las siguientes cuatro condiciones de almacenamiento:
-Temperatura controlada, desecada (de aquí en adelante abreviada 'TC_D'): los portaobjetos se almacenaron en una cámara de desecación colocada en una sala con temperatura controlada (temperatura promedio de 21  ° C).
-Congelado a -20  ° C, desecado (abreviado 'Congelado'): Los portaobjetos se almacenaron en cajas de plástico individuales que contenían sobres de sílice y se sellaron en bolsas de plástico antes de la congelación.
-37 ° C, desecado (abreviado '37C'): los portaobjetos se almacenaron en una caja de plástico oscura que contenía sobres de sílice y se almacenaron en una incubadora a 37 ° C.
-Temperatura ambiente, no desecada (RT_ND abreviado). Como esta era la única condición de almacenamiento para la cual la temperatura y la humedad no estaban controladas, registramos la temperatura diaria en grados Celsius (C) y la humedad relativa (RH) expresada en porcentajes (Lascar Electronics, Easy Log USB, versión 7.2.0.0) sobre un período de aproximadamente 16 meses (los datos se registraron entre el 24 de octubre de 2012 y el 16 de enero de 2013, así como entre el 19 de marzo de 2013 y el 21 de febrero de 2014, respectivamente).

Línea de tiempo del experimento. El período de estudio abarcó un total de 22 meses. Las pruebas periódicas de diapositivas de microarrays manchados se realizaron en un intervalo de 2 meses. Por punto de tiempo de prueba, se probaron cuatro diapositivas, una diapositiva por condición de almacenamiento, simultáneamente. La temperatura y la humedad relativa se registraron (indicadas por bloques grises) durante parte del estudio para la condición 'Temperatura ambiente, no desecada'.

Estabilidad de virus (virus de la gripe A y sarampión) y antígenos bacterianos (S. pneumoniae) impresos en portaobjetos de microarrays almacenados en cuatro condiciones diferentes de temperatura y humedad. La estabilidad del antígeno se evaluó mediante pruebas periódicas utilizando alícuotas de grupos de suero específicos a intervalos de dos meses (eje x) que cubren un período total de estudio de 22 meses. Los títulos de Log2 se muestran en el eje y. Los paneles horizontales representan diferentes condiciones de almacenamiento por antígeno. Las líneas de color muestran el título mediciones por antígeno y condiciones de almacenamiento. Las líneas horizontales, punteadas y negras corresponden a los títulos geométricos medios respectivos. Las mediciones fueron aceptables si permanecían dentro de un rango de más / menos un paso de dilución del log2-titer medio. Las cintas grises muestran un intervalo de confianza del 95% alrededor de una línea de regresión lineal invisible para indicar tendencias en la estabilidad del antígeno a lo largo del tiempo. Las mediciones basales (prueba 0) se combinan en una sola marca.

Referencias bibliográficas:

1. Freidl G, Bruin E, Schipper M, Koopmans M. Exploring novel sero-epidemiological tools—Effect of different storage conditions on longitudinal stability of microarray slides comprising influenza A-, measles- and Streptococcus pneumoniae antigens. Journal of Virological Methods [Internet]. 2017 [cited December 2019];245:53-60. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0166093416305213

2. Aman M. LIBRO DE APOYO DIDACTICO EN BIOLOGIA MOLECULAR FCM UCE marzo 2015 [Internet]. Joomag. 2015 [cited December 2019]. Available from: https://view.joomag.com/libro-de-apoyo-didactico-en-biologia-molecular-fcm-uce-marzo-2015/0169164001409963499?short